iroyin

IPTG (isopropyl-β-D-thiogalactoside) jẹ afọwọṣe ti sobusitireti β-galactosidase, eyiti o jẹ inducible gaan.Labẹ ifakalẹ ti IPTG, olupilẹṣẹ le ṣe eka kan pẹlu amuaradagba repressor , Ki iyipada ti amuaradagba repressor ti yipada, ki o ko le ṣe idapo pẹlu jiini ibi-afẹde, ati jiini ibi-afẹde ti ṣafihan daradara.Nitorinaa bawo ni o yẹ ki o pinnu ifọkansi ti IPTG lakoko idanwo naa?Ṣe o tobi julọ dara julọ?
Ni akọkọ, jẹ ki a loye ilana ti ifasilẹ IPTG: E. coli's lactose operon (ano) ni awọn jiini igbekale mẹta, Z,Y, ati A, eyiti o fi koodu β-galactosidase, permease, ati acetyltransferase, lẹsẹsẹ.lacZ hydrolyzes lactose sinu glucose ati galactose, tabi sinu allo-lactose;lacY ngbanilaaye lactose ni agbegbe lati kọja nipasẹ awo sẹẹli ati wọ inu sẹẹli;lacA n gbe ẹgbẹ acetyl lati acetyl-CoA si β-galactoside, eyiti o kan yiyọ ipa majele kuro.Ni afikun, o wa ni ọna ṣiṣe kan O, ilana ibẹrẹ P ati jiini ilana I. koodu jiini I jẹ amuaradagba repressor ti o le sopọ mọ ipo O ti ọkọọkan oniṣẹ, ki operon (meta) ti wa ni titẹ ati ni pipa.Aaye abuda tun wa fun ibi isunmọ catabolic gene activator protein-CAP abuda aaye ti o wa ni oke ti ipilẹṣẹ ipilẹṣẹ P. Ilana P, O lẹsẹsẹ ati aaye abuda CAP papọ jẹ agbegbe ilana ti lac operon.Awọn jiini ifaminsi ti awọn enzymu mẹta jẹ ilana nipasẹ agbegbe ilana kanna lati ṣaṣeyọri ikosile isọdọkan ti awọn ọja jiini.

Ni aini ti lactose, lac operon (meta) wa ni ipo ipadanu.Ni akoko yii, lac repressor ti a fihan nipasẹ ilana I ti o wa labẹ iṣakoso ti ilana olupolowo PI sopọ mọ ọkọọkan O, eyiti o ṣe idiwọ RNA polymerase lati dipọ si ọna P ati ki o ṣe idiwọ ibẹrẹ transcription;nigba ti lactose ba wa, lac operon (meta) le ṣe ifilọlẹ Ninu eto operon (meta) yii, inducer gidi kii ṣe lactose funrararẹ.Lactose wọ inu sẹẹli ati pe o jẹ catalyzed nipasẹ β-galactosidase lati yipada si allolactose.Awọn igbehin, bi ohun inducer moleku, sopọ si awọn repressor amuaradagba ati ki o yi awọn amuaradagba conformation, eyiti o nyorisi si awọn dissociation ti awọn repressor amuaradagba lati O lesese ati transcription.Isopropylthiogalactoside (IPTG) ni ipa kanna bi allolactose.O jẹ inducer ti o lagbara pupọ, eyiti ko ni iṣelọpọ nipasẹ awọn kokoro arun ati pe o jẹ iduroṣinṣin pupọ, nitorinaa o jẹ lilo pupọ ni awọn ile-iwosan.

Bii o ṣe le pinnu ifọkansi ti o dara julọ ti IPTG?Mu E. coli gẹgẹbi apẹẹrẹ.
E. coli BL21 igara ti o ni imọ-jiini ti o ni awọn pGEX recombinant rere (CGRP/msCT) ni a fi sinu omi LB ti o ni 50μg · mL-1 Amp, ati gbin ni alẹ ni 37 ° C.Aṣa ti o wa loke ti wa ni inoculated sinu awọn igo 10 ti 50mL alabapade LB omi alabọde ti o ni 50μg · mL-1 Amp ni ipin ti 1: 100 fun aṣa imugboroja, ati nigbati iye OD600 jẹ 0.6 ~ 0.8, IPTG ti wa ni afikun si ifọkansi ikẹhin.O jẹ 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6, 0.7, 0.8, 0.9, 1.0mmol·L-1.Lẹhin ifasilẹ ni iwọn otutu kanna ati akoko kanna, 1 milimita ti ojutu kokoro-arun ni a gba lati inu rẹ, ati pe a gba awọn sẹẹli kokoro nipasẹ centrifugation ati tẹriba si SDS-PAGE lati ṣe itupalẹ ipa ti awọn ifọkansi IPTG oriṣiriṣi lori ikosile amuaradagba, ati lẹhinna. yan ifọkansi IPTG pẹlu ikosile amuaradagba ti o tobi julọ.
Lẹhin awọn idanwo, yoo rii pe ifọkansi ti IPTG ko tobi bi o ti ṣee.Eyi jẹ nitori IPTG ni majele kan si awọn kokoro arun.Ti o kọja ifọkansi yoo tun pa sẹẹli naa;ati ni gbogbogbo, a nireti pe amuaradagba tiotuka diẹ sii ti a ṣalaye ninu sẹẹli, o dara julọ, ṣugbọn ni ọpọlọpọ awọn ọran nigbati ifọkansi ti IPTG ba ga ju, iye nla ti ifisi yoo ṣẹda.Ara, ṣugbọn iye amuaradagba tiotuka dinku.Nitorinaa, ifọkansi IPTG ti o dara julọ nigbagbogbo kii ṣe tobi julọ dara julọ, ṣugbọn ifọkansi kekere.
Idi ti ifakalẹ ati ogbin ti awọn igara ti a ṣe nipa ẹda ni lati mu ikore ti amuaradagba ibi-afẹde pọ si ati dinku awọn idiyele.Ikosile ti jiini ibi-afẹde ko ni ipa nipasẹ awọn okunfa ti ara ti igara ati plasmid ikosile, ṣugbọn tun nipasẹ awọn ipo ita miiran, gẹgẹbi ifọkansi ti inducer, iwọn otutu fifa irọbi ati akoko ifilọlẹ.Nitorinaa, ni gbogbogbo, ṣaaju ki o to ṣafihan amuaradagba ti a ko mọ ati di mimọ, o dara julọ lati ṣe iwadi akoko ifisi, iwọn otutu ati ifọkansi IPTG lati yan awọn ipo ti o yẹ ati gba awọn abajade esiperimenta to dara julọ.